转基因植物中标记基因的剔除
目前植物转基因技术中的DNA递送(即将外源 DNA片段插入到植物基因组的转化)过程都是在组织水平上进行，转化后的植物组织中只有一部分细胞的基因组整合进了外源DNA，所以同时还存在着未转化的细胞。通常用标记基因将转化细胞从未转化的细胞中筛选出来。常用的标记基因大多是一些对抗生素或除草剂的抗性基因。当用它与关注基因共转化植物细胞时，就可以为植物细胞提供在含有抗生素或除草剂的培养基上生长的能力，而未转化细胞不能在这样的培养基上生长，因此存活下来的细胞就只有转化细胞。但是，标记基因并不参与植物的性状改良，在完成筛选后它在植物中的存在便是多余的。这种多余的基因会带来一些负效应。首先，在转化细胞的筛选过程中，大量生长受到抑制的未转化的细胞会阻碍转化细胞对营养物质的吸收，并且还可能分泌一些有毒的物质抑制转化细胞的生长。其次，用重转化(re-transformation)方法进行基因堆积(gene stacking)时，每一次转基因的插入都需要进行转化筛选；但可用于植物转基因筛选的标记基因只有少数几个，不能满足重转化对多个标记基因的要求，因此只能在一次转化后从植物基因组中剔除标记基因，以便下一次转化时使用同一个标记基因。然而，标记基因最令人关注的方面还在于其潜在的“流动”——基因的水平转移与基因逃逸可能产生的生物安全性问题：作为标记基因的抗生素抗性基因一旦流动到危害人类健康的微生物中就会为其提供抗药性，而除草剂抗性基因如果流动到危害粮食作物生长的杂草中就会使其获得除草剂抗性而成为“超级杂草”。所以，标记基因的剔除(selectable marker-free，SMF)已成为了转基因植物研究中的新课题。
根据不同原理，剔除标记基因的方法可以分为两类：分离剔除和重组剔除。前者是通过标记基因与关注基因分别插入到植物基因组的非连锁位点上，再经减数分裂实现标记基因与关注基因的分离，而达到标记基因剔除的目的。后者是将标记基因构建在DNA裁剪单元中，由起裁剪作用的酶(重组酶或转座酶)识别并切除裁剪单元，从而将标记基因从植物基因组中剔除。本文对这两种方法分别进行阐述。
1 标记基因的分离剔除法
1.1 原理
以土壤农杆菌的T-DNA为基因转移载体的转化中，标记基因与关注基因以紧密连锁的方式构建在一个T-DNA单元中，因此两者总是共整合进植物基因组中，从而很难通过在减数分裂的细胞中的基因的自由组合或交叉互换相互分离。要实现转化后标记基因与关注基因的分离，可以将这两类基因分别设计在两个T-DNA单元中，使它们分别插入而非共整合到植物基因组中(Komari等， 1996)。由于T-DNA的插入是随机的，因此插入后的标记基因与关注基因可能分别位于不同染色体上，即非连锁位点上，或位于同一染色体相距较远的位点上；减数分裂后，标记基因与关注基因就可以分离，从而在下一代中获得无标记基因的转基因植物。
1.2 类型
根据所使用土壤农杆菌的种类、Ti质粒的种类以及两个T-DNA在Ti质粒上位置关系的不同，标记基因的分离剔除法可分为5种类型。
(1)分别构建标记基因与关注基因的两个T- DNA位于两个Ti质粒上，分别用两种土壤农杆菌株共转化植物细胞。
(2)分别构建标记基因与关注基因的两个T- DNA位于两个Ti质粒上，用一种土壤农杆菌株转化植物细胞。
(3)分别构建标记基因与关注基因的两个T- DNA位于同一个Ti质粒上，标记基因与关注基因之间由大片段的毒力基因(virulence gene)相隔开。用两组T-DNA的边界序列(左，LB和右，RB)，其中，一组界定标记基因，另一组界定关注基因。
(4)分别构建标记基因与关注基因的两个T- DNA紧密排列于同一个Ti质粒上。
(5)将标记基因与关注基因设计在带双右边界序列(double right border，DRB)一个T-DNA单元中。作者等(Lu等，2001)构建了一个DRB的双载体 (binary vector)(图1)，获得带有水稻齿裂矮缩病毒基因组的第5个基因片段S5关注基因的SMF转基因水稻，Southern blot试验证明，64％的Jarrah水稻产生SMF子代，而中国水稻品种--秀水为36％， SMF子代中含有关注基因的植株小于50％。
1.3 分析
设计在同一个T-DNA单元中的标记基因与关注基因，由于位于同一转移单元中，所以总是共整合进植物基因组中。这时标记基因的功能表现在两个水平上：基因水平上对关注基因整合事件的标记功能和细胞水平上对转化细胞的筛选功能。而当标记基因和关注基因分别位于两个T-DNA中时，它们之间的共整合关系就不存在了，因此标记基因也就不具备对关注基因整合事件的标记功能，它在整个转化过程中的作用仅体现在对转化细胞的筛选上。因此，标记基因的分离剔除首先需要从带有标记基因的(即能在选择性培养基上生长的)T0代植株中，筛选同时含有关注基因的植株，也就是筛选标记基因与关注基因共转化的植株。
综上所述，标记基因的分离剔除有两个中心事件——标记基因与关注基因的共转化和分离；对应于两个筛选过程——T0代共转化植株的筛选和T1代无选择标记植株的筛选；因此有两个衡量用的比率——T0代的共转化率和T1代的分离率。
2 标记基因的重组剔除法
与标记基因分离剔除法不同，重组剔除法无需将标记基因和关注基因分别插入到两个T-DNA 中，两者仍然以紧密连锁的方式构建在一个T- DNA中；但在标记基因的两端插入DNA裁剪系统的识别序列，即构成一个裁剪单元，在起裁剪作用的酶的作用下将它裁剪除去。也就是说， DNA重组系统是由识别序列界定的裁剪单元和起裁剪作用的酶两个部分组成，在标记基因完成对转化细胞的筛选后，将它从植物基因组中剔除。在这一裁剪过程中有两个核心问题：首先是裁剪发生时间的控制，即裁剪应在标记基因完成筛选之后进行；其次是裁剪事件的检测，即裁剪事件只发生在部分转化细胞中，需要筛选标记基因已从植物基因组中裁剪除去的转化细胞。在讨论这两个核心问题前，先就已用于标记基因裁剪剔除的DNA裁剪系统作简要介绍。
2.1 DNA裁剪系统
用于从转基因植物里剔除标记基因的裁剪系统实质上是一些DNA重组系统，主要包括位点特异性重组系统和转座系统两种。这两种系统都是由裁剪单元即标记基因(由左右两端短小的DNA裁剪酶的目的序列所界定)和起裁剪作用的酶两部分组成。在酶的裁剪作用下，DNA在两个相邻识别位点之间发生染色体内重组，将位于识别位点间的DNA片段从染色体上裁剪下来；所不同的是，转座系统中裁剪下来的DNA片段可能重新插入到染色体的另一位点上，而位点特异性重组系统中裁剪下来的DNA片段则会丢失。
位点特异性重组系统：已发现的在植物中有效的位点特异性重组系统包括大肠杆菌噬菌体P1 的Cre/loxP系统(Odell等，1990)、接合酵母 (Zygosaccharomyces rouxii)的R/rs系统(Sugita等， 2000)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Flp/ frt系统(Lloyd和Davis，1994，Seibler等，1998)和大肠杆菌噬菌体λ的Xis/attP系统(Better等，1983) 等。其中Cre/loxP是较常用的系统，已经在水稻研究中获得很好的应用(Tran等，1999)。McCormac 等(1999)在此系统基础上，发展了很有用的双载体体系。
转座系统：目前已经报告的用于转基因植物标记基因剔除的转座系统是来源于玉米的Ac/ds系统(Hehl和Baker，1990)。
如上文所述，转座系统中裁剪下来的DNA片段可能重新插入到染色体的另一位点上，如果新旧两个位点分布于两条染色体上，就可以通过减数分裂将标记基因与关注基因进行分离，但如果新旧两个位点处在同一染色体上，其中还需要有交换(crossover)。因此，在裁剪单元中既可构建标记基因又可构建关注基因，但是无标记基因的转基因植株要在下一代中才能筛选得到。
2.2 裁剪发生时间的控制
标记基因的剔除应在转化筛选以后进行，因此通常先将裁剪单元和它以外的紧邻的关注基因插入到植物基因组中，再将进行裁剪用的酶基因引入；在标记基因随裁剪单元除去后，插入在植物基因组中的起裁剪作用的酶基因再经过减数分裂与关注基因分离，这样在子代中可以得到只带有关注基因的转基因植株。将裁剪酶基因引入到已插入了标记基因的转基因植物基因组中的方法有重转化和杂交授粉(cross-pollination)两种。重转化是在 T0代标记基因对关注基因的转化筛选完成以后，再通过对酶基因裁剪的转化筛选出的组织。因此标记基因在T0代就可以从植物基因组中剔除；但后引入的裁剪酶基因又必须经过减数分裂在T1代与关注基因分离，得到只带有关注基因的转基因植株。而杂交授粉是通过T0代的精子细胞引入裁剪酶基因的，因此标记基因要在T1代才能剔除，裁剪酶基因要在T2代才能与关注基因分离。此外，两种方法引入裁剪酶基因后的裁剪发生率有较大差异，例如重转化引入Cre重组酶的裁剪发生率明显高于杂交授粉，且稳定在90％～95％，推测这可能与不同细胞中Cre蛋白的表达差异有关。
上述将裁剪系统的两个组分分别引入植物基因组的方法虽然确保了标记基因在转化筛选后才被裁剪剔除，但却很费时和消耗人工和材料。如果将标记基因与裁剪的酶基因紧密排列在一个裁剪单元中同时插入到植物基因组里，就可以在T0代中筛选出标记基因与裁剪的酶基因都被剔除了的只带有关注基因的转基因植株。但是标记基因与裁剪酶基因共整合进植物基因组过程中，裁剪酶基因的表达可能使标记基因也被过早地裁剪除去，因此应将裁剪酶基因置于诱导型启动子的调控之下，使标记基因在完成转化筛选后再被裁剪剔除。 Zuo等(2001)在转基因拟南芥中用β-雌二醇(β- estradiol)诱导表达系统控制Cre基因的表达。在 Cre基因的CaMV35S启动子的上游融合了8个拷贝的Lex A操纵子(operator)序列，使Cre基因可以在β-雌二醇的诱导下表达。他们以GFP基因作为报告基因，将包含标记基因、Cre基因和XVE 反式激活基因的裁剪单元插入在GFP的启动子和编码区之间，因此只有当裁剪单元被剔除以后， GFP基冈才能表达。首先在选择性培养基上筛选转化组织，这时检测不到GFP的表达；再将转化组织转移到含β-雌二醇的诱导培养基上培养，结果在所有转化系中都检测到了GFP的表达。这说明β-雌二醇诱导表达系统可以严格控制并高效诱导裁剪酶基因的表达。在另一实验中，R/rs系统中的R重组酶在Safener诱导的GST-II-27启动子调控下实现了诱导表达。
2.3 裁剪细胞的筛选
上述的β-雌二醇诱导的Cre/loxP系统在T0代的干细胞(germ cell)中只有约29％～66％发生了裁剪事件。因此，诱导裁剪后的植株组织实际上是嵌合体，需要将发生了裁剪的细胞从中筛选出来。这可通过负选择标记基因进行。所谓负选择标记基因是指其产物在一定条件下可以对细胞产生毒性，使带有负选择标记基因的细胞在这样的条件下不能存活。例如来源于大肠杆菌的胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase，cod A)基因是一种条件致死性显性基因，可以将无毒性的5-氟胞嘧啶转变成5-氟尿嘧啶，后者是胸苷酸合成酶不可逆抑制剂5-氟脱氧鸟苷--磷酸的前体分子，结果使细胞因缺乏脱氧胸苷三磷酸而不能合成DNA。将这类负选择标记基因构建在裁剪单元中，只有发生了裁剪事件即负选择标记基因与标记基因、裁剪酶基凶一同从植物基因组中剔除了的细胞才能存活下来。cod A基因已被用于无标记基因的转基因烟草的筛选(Gleave等，1999； Corneille等，2001)。
除了负选择标记基因，一类促进植物细胞繁殖与分化的基因也可以用于裁剪细胞的筛选。这类显性基因在促进植物细胞生长的同时，也使植物形成异常的形态结构。如A．tumefaciens PO22 的异戊烯基转移酶基因可以催化细胞激动素 (cytokinin)的合成，促使转化细胞的增殖并分化形成不同于正常苗(normal shoot)的不定苗 (adventitious shoot)；Ebinuma等(1997)和Endo等 (2002)构建了一种MAT(multi-auto-transformation) 的新的植物载体系统，它含有插入于转座子AC 内的嵌合的ipt基因，该ipt基因即可作为转化的标记基因。MAT载体系统可以大大缩短育种时间，从而对木本植物特别有用。来源于A． rhizogenes NIAESl724的rol基因通过提高生长素 (auxin)的敏感性促进转化组织"发根(hairy root)"的增生。这些异常的形态特征可以作为转化细胞的筛选标记，替代用抗生素或除草剂等选择性试剂杀死非转化细胞的筛选方法。进一步，如果将这类生长促进基因构建在裁剪单元中，当它在裁剪酶作用下从植物基因组中除去后，转基因组织就会形成正常的形态结构，这时这类生长促进基因又充当了裁剪剔除的筛选标记。如随着 ipt基因的剔除，顶端优势(apical dominance)和生根能力就会恢复，会在转化筛选后形成的不定茁中出现形态正常的苗，后者即是剔除了标记基因的转基因组织。由此可见，植物的生长促进基因既可以作为转化的筛选标记(异常形态)又可以作为裁剪的筛选标记(正常形态)，同时承担了无标记基因的转基因植物培育过程中所需的两个筛选功能。
转基因植物标记基因剔除方法的核心是标记基因与关注基因的分离。在分离剔除法中，标记基因与关注基因被分别构建在两个T-DNA中，因此在转化植物组织以前就已经“人工分离”了；在裁剪剔除法中，标记基因与关注基因被紧密连锁地构建在一个T-DNA中，标记基因通过裁剪系统从植物基因组中裁剪剔除，因此是在转化后的植物组织中与关注基因分离的。由于分离剔除法中标记基因与关注基因在转化植物组织以前就已经分离，因此标记基因对关注基因插入的标记功能随两者共整合关系的解除而丧失，相应的有效转化率也就降低了。从这一点上考虑，裁剪剔除法具有优势。在裁剪剔除法中，裁剪发生时间的控制和裁剪细胞的筛选是关键问题，可以通过对裁剪单元的改进设计加以解决：将裁剪酶基因设计在诱导型启动子的下游以控制裁剪发生的时间；用负选择基因或特殊的植物生长促进基因筛选裁剪细胞。
